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Microscope à fluorescence :

Introduction sur la microscopie à fluorescence

 

La microscopie à fluorescence est aujourd'hui très largement utilisée en recherche biologique et dans le milieu médical.

 

1) Les différents éléments d'un microscope à fluorescence

 

Un microscope à fluorescence est un microscope photonique, composé :

 

->de 2 sources de lumières :

 

- une lampe halogène pour étudier les échantillons en transmission comme avec les microscopes de routine classiques.

-une lampe à arc (par exemple une lampe à vapeur de mercure) qui possède des raies caractéristiques dans son spectre et qui permet d'exciter les fluorochromes utilisés pour marquer l'échantillon.

 

->d'un trajet optique qui comprend différentes lentilles, des prismes, des cubes de fluorescences (filtre d'excitation + miroir dichroïque + filtre d'émission), des objectifs et des oculaires.

 

->d'un capteur (le plus souvent un capteur CCD).

 

2) Fonctionnement

 

Ce type de microscope, permet de visualiser la fluorescence émise par les marqueurs fluorescents introduits dans l'échantillon à étudier. Pour cela, le microscope est équipé d'un jeu de filtres et de miroirs dichroïques. On trouve dans le microscope deux types de filtres. Des filtres d'excitation, qui permettent de sélectionner les longueurs d'ondes qui vont exciter l'échantillon et des filtres d'émission qui vont permettre d'éliminer lors de l'observation, certaines longueurs d'ondes émises par le fluorochrome en réponse à l'excitation.

 

3) Images obtenues

 

Pour la visualisation d'un même échantillon comprenant 3 marqueurs différents, il faut réaliser 3 prises de vues (une pour chaque marqueur). Ces trois clichés peuvent ensuite être superposés pour former une seule et même images.

Les capteurs équipant ce type de microscope sont le plus souvent des capteurs CCD noir et blanc. Les images obtenues sont donc en noir et blanc mais il est possible de colorer les images avec de fausses couleurs pour repérer plus facilement les différents marqueurs dans l'échantillon étudié.

 

4) Avantages et inconvénient

 

Avantages :

 

- Prise en main du microscope facile et rapide

- Acquisition des images rapide

- Particulièrement adapté pour l'étude d'échantillon sensibles au forte illumination comme les cellules vivantes.

 

Inconvénient :

 

- Les images peuvent manquer de netteté, entre autre, à cause de la visualisation de la fluorescence émise hors focus. Pour remédier à ce problème, il est possible de déconvoluer les images. Ce traitement permet grâce à un calcul, d'éliminer le flou dû à la fluorescence émise hors focus.

 

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