|
Contexte scientifique
Isoler et maîtriser ex vivo le destin des cellules souches somatiques permet d'apporter des éléments de réponse à la question centrale: quelles molécules et quels mécanismes moléculaires gouvernent le choix et les étapes du programme génétique de différenciation d'une cellule souche et contrôlent l'expression des fonctions cellulaires spécialisées des cellules-filles différenciées ? Les cellules souches sous-tendent de nombreux enjeux à l’interface fondamentale/clinique. Identifier les voies de signalisation qui gouvernent le programme intrinsèque d’une cellule souche est un défi majeur pour les thérapies cellulaires des prochaines années.
Chaque nouveau modèle de différenciation cellulaire offre également l’opportunité d’étudier dans un contexte phénotypique intégré la régulation de protéines (transporteurs, récepteurs, enzymes…) qui sont des acteurs clés de l’homéostasie cellulaire et des cibles thérapeutiques. L’inductibilité de lignées précurseurs de lignage permet de prendre en compte la dynamique de différenciation dans l’étude des interactions agents pathogènes–cellules hôtes (prions-neurones) ou dans les réponses aux agents pharmacologiques et xénobiotiques (susceptibilité des cellules souches vs cellules différenciées). Face aux mécanismes qui sous-tendent la neurodégénérescence ou la toxicologie cellulaire, des modèles in vitro ouvrent un chemin pour tenter de cerner la séquence des événements qui aboutissent à une déviation des fonctions cellulaires et in fine à une perte d’homéostasie.
Tous les travaux de l’équipe sont basés sur l’établissement de lignées précurseurs de lignage qui ont été isolées et clonées à partir de cellules embryonnaires totipotentes. Ces cellules précurseurs ont les propriétés de cellules souches somatiques multipotentes. Elles présentent un phénotype homogène, stable et indifférencié. Selon la nature des inducteurs, presque 100% des progéniteurs s’engagent vers différents programmes le long d’un seul lignage. Leur programme intrinsèque leur permet d’acquérir les fonctions spécialisées du stade terminal de(s) différenciation(s). Nous privilégions l’étude (i) d’une cellule souche neuroectodermique, précurseur de neurones sérotoninergiques ou noradrénergiques qui nous a permis de développer un axe « prions » et (ii) de lignées mésoblastiques capables de récapituler in vitro les étapes de l’ostéogénèse, la chondrogénèse, l’adipogénèse ou l’odontogénèse.
Objectifs, activité, projets
Nos travaux s'articulent donc autour de 2 axes de recherche majeurs : « Neuro-prion » et « précurseurs des tissus minéralisés ». Les projets sont principalement centrés sur les acteurs des voies de signalisation qui régissent l’acquisition, le maintien et la coordination des fonctions neuronales ou la formation des matrices minéralisées.
Nos travaux exploitent les propriétés d’une lignée neuroectodermique (1C11), précurseur de neurones sérotoninergiques (1C115-HT) ou noradrénergiques (1C11NE). La lignée 1C11 représente le seul modèle in vitro capable de mettre en place l’ensemble des fonctions des neurones sérotoninergiques ou noradrénergiques.
Nous avons tiré profit de ce modèle pour rechercher des microARNS impliqués dans la régulation des fonctions spécialisées des cellules différenciées et nous avons identifié miR-16 qui contrôle l’expression protéique du transporteur de la sérotonine (SERT), cible des antidépresseurs de la famille des SSRI (Serotonin Selective reuptake Inhibitor). MiR-16 est faiblement exprimé dans les neurones sérotoninergiques (1C115-HT et raphé), là où le SERT est présent. Par contre, il est fortement exprimé dans les neurones noradrénergiques (1C11NE ou locus coeruléus). Avec un anti-miR-16, on induit l’expression du SERT dans les neurones noradrénergiques et on les dote de la capacité à fixer les antidépresseurs.
Chez les patients, les SSRIs bloquent la fonction du SERT, mais diminuent aussi l’expression de cette protéine sans affecter le niveau de ses ARNm, ce qui évoque un contrôle post-transcriptionel de l’expression du SERT. Nous avons donc recherché in vivo si miR16 pouvait contribuer à l’action des antidépresseurs. Chez la souris, le traitement chronique par la fluoxetine augmente le niveaux de miR-16 dans le raphé ce qui conduit à une diminution de l’expression du SERT. Au niveau mécanistique, nous avons pu relier l’augmentation de miR-16 à une activation de GSK3b, un effecteur de la voie Wnt canonique. Un deuxième niveau de réponse des neurones sérotoninergiques (1C115-HT et raphé) à la fluoxetine est la libération du facteur neurotrophique S100ß. La protéine S100ß sécrétée par les neurones du raphé induit une diminution de miR-16 et dévérouille l’expression du SERT et des fonctions sérotoninergiques dans ces neurones noradrénergiques du locus coeruleus (ou 1C11NE).
Plus récemment, nous avons montré que miR-16 est également impliqué dans l'action de la fluoxetine au niveau de l'hippocampe. Dans cette région du cerveau, un traitement chronique par la fluoxetine induit une diminution de miR-16, qui a pour conséquence une induction de l'expression du SERT, mais également du facteur anti-apoptotique bcl-2, et une augmentation de la maturation de nouveaux neurones. Ce travail permet d'identifier miR-16 comme "un chaînon manquant" entre l'action des antidépresseurs et la neurogenèse dans l'hippocampe. Enfin, nous montrons quer l'action de la fluoxetine sur l'hippocampe requiert une synergie de trois signaux: BNDF, Wnt 2 et 15?PGJ2, dont le niveau est augmenté in vivo chez la souris ou les patients traités à la fluoxetine.
Ces travaux, effectués en collaboration étroite avec J.M. Launay (Hôpital Laribooisière, Paris) et Hoffmann-LaRoche (Bâle), ont également permis de monter l’effet bénéfique de la régulation de miR-16 induite par la fluoxetine, dans des modèles animaux de dépression (Baudry et al, Science 2010; Launay et al., Transl Psy 2011)- Abstract » PDF »
Un autre projet développé autour de l’axe « neuroprion » vise à caractériser le rôle biologique de la protéine prion cellulaire (PrPC), en fonction du contexte cellulaire. La conversion de la protéine prion cellulaire en forme Scrapie (PrPSc) est à l’origine des encéphalopathies spongiformes transmissibles (EST), un groupe de maladies neurodégénératives dont les plus connues sont la maladie de Creutzfeldt-Jakob chez l’homme et l’ESB ou maladie de la vache folle chez les animaux. La PrPC est une protéine ubiquitaire, fortement exprimée à la surface des neurones. La toxicité de la PrPSc ne s’exerce que dans un contexte neuronal et requiert la présence de la PrPC. Une des hypothèses actuelles est que, au-delà de son rôle ubiquitaire, la PrPC exercerait une fonction neurospécifique dont la déviation par la PrPSc provoquerait la dégénérescence neuronale. Comprendre le rôle exercé par la PrPC dans les neurones représente donc un enjeu important pour cerner les mécanismes cellulaires et moléculaires qui sous-tendent la toxicité de la PrPSc.
Les travaux de notre laboratoire sont notamment centrés sur les cascades de transduction du signal dépendantes de la PrPC. En développant une stratégie basée sur la lignée neuronale 1C11 et l’utilisation d’anticorps (crosslinking), nous avons en effet assigné une fonction de signalisation à la PrPC. Nos données étayent un rôle ubiquitaire de la PrPC dans le contrôle de l’état redox et de l’homéostasie cellulaires, via la mobilisation de la NADPH oxidase, des kinases ERK1/2 et du facteur de transcription CREB. Elles mettent de plus en évidence une action neurospécifique de la PrPC liée à la formation d’une plateforme de signalisation intégrant la PrPC elle-même, la cavéoline et la kinase Fyn et au contrôle des métalloprotéases matricielles. Enfin, nous avons établi un lien fonctionnel entre PrPC et libération de TNFa dans les cellules neuronales 1C115-HT et 1C11NE, relayé par la NADPH oxydase et la métalloprotéase TACE. Le TNFa exerce à son tour une action neuromodulatrice sur les cellules neuronales en induisant la dégration du neuromédiateur. L’ensemble de nos données plaident en faveur d’un rôle ubiquitaire de la PrPC dans le contrôle de l’état redox et de la survie cellulaire et d’un rôle neurospécifique dans la plasticité synaptique et dans l’homéostasie des neurones bioaminergiques.
Les cellules 1C11 sont chroniquement infectables par plusieurs souches de prions et nous étudions l'impact de l'infection sur les voies de signalisation dépendantes de la PrPC.
La protéine prion : une protéine « multifacettes »
Notre objectif est également d'étudier comment une perte d’expression de la PrPC affecte le statut des cellules souches 1C11 et la mise en place d’un phénotype neuronal. Un vecteur d’expression stable de siARN dirigé contre la PrPC a été construit et introduit dans la lignée 1C11. Nos données montrent que l’absence de PrPC dans la cellule souche 1C11 empêche la mise en place de la polarité neuronale en introduisant un déséquilibre au niveau des interactions matrice extracellulaire-cytosquelette. La perte d’expression de la PrPC est associée à une augmentation de l'activité des intégrines de type beta 1, qui entraîne un recruitement accru de la voie RhoA-Rho kinase-LIMK-cofilin, un délai du turnover des points d'adhérences focaux et une rigidité du cytosquelette d'actine (Loubet et al., FASEB 2011).
Cet axe s’appuie notamment sur la lignée mésoblastique (C1) capable de récapituler in vitro les étapes de l’ostéogénèse, la chondrogénèse ou l’adipogénèse. Dans le cadre de l’axe « tissus minéralisés », nous avons mis en évidence un lien biochimique entre un récepteur sérotoninergique (5-HT2B) et l’activité de la phosphatase alcaline tissu-non spécifique (TNAP), une enzyme majeure de la minéralisation osseuse. Les cellules mésoblastiques C1 sont capable de se différencier en ostéocytes matures en 12 jours et mettent en place le récepteur 5-HT2B juste avant la phase de minéralisation (jour 5). Ce récepteur est couplé à la phospholipase A2 et contrôle, par son activité intrinsèque, la production d’eicosanoïdes. Nos travaux récents montrent qu’une cible en aval du couplage 5-HT2B-PLA2 est la TNAP. Le contrôle de l’activité TNAP par le récepteur 5-HT2B s’opère par des mécanismes pos-traductionnels, via les écoisanoïdes et la phosphatidylinositol-specific phospholipase C, qui clive l’ancre GPI de la TNAP. Enfin, nous avons exploité les souris KO pour le récepteur 5-HT2B, qui présentent des anomalies cranio-faciales et un phénotype ostéopénique, pour confirmer le lien fonctionnel entre le 5-HT2BR et la TNAP et le rôle de la PIPLC sur l’activité de la TNAP sur des cultures primaires de calvaria (wt vs 5-HT2BR-/-) (Baudry et al., JBC 2010).
Dans le cadre de l’étude des tissus minéralisés, le laboratoire a aussi isolé des cellules souches de pulpe dentaire, ce qui suscite un intérêt clinique en raison des applications thérapeutiques potentielles. L'étude du potentiel de différenciation de ces lignées révèle que certains clones ont un potentiel restreint, tandis que d'autres sont capables, selon la nature des inducteurs, d'atteindre les stades terminaux des différenciations ostéogéniques, odontogéniques, chondrogéniques ou adipocytaires. Enfin, nos données indiquent que l'implantation de ces clones pulapires dans une incisive lésée chez la souris est capable d'induire une réparation dentinaire. Ces travaux pourraient ouvrir la voie au développement de nouvelles approches conservatrices en biodentisterie.
|
