Notre équipe explore depuis plusieurs années différentes stratégies pharmacologiques pour la correction de ces déficits, en se basant à la fois sur des éléments issus du domaine de la génétique humaine, et sur des données fondamentales concernant les mécanismes de régulation des voies métaboliques mitochondriales. En effet, on sait maintenant qu’une proportion élevée des déficits identifiés chez l’homme ne correspond pas à une absence complète de la protéine mutée. Ainsi, l'étude biochimique des cellules de patients met souvent en évidence la production d'une protéine mutée, généralement instable et donc présente en très faible quantité, qui exprime souvent une faible activité enzymatique résiduelle. La quantité de protéine et l’activité enzymatique résiduelle sont variables en fonction de la nature des mutations, mais constituent des caractéristiques importantes dans une stratégie thérapeutique. En effet, on sait que l'expression des enzymes du métabolisme oxydatif mitochondrial est placée sous le contrôle de nombreuses voies de signalisation, agissant au niveau transcriptionnel ou post-transcriptionnel, qui assurent le contrôle des niveaux de protéine enzymatique et/ou de leur activité. Nous avons donc émis l'hypothèse qu'une activation pharmacologique de ces voies de signalisation pourrait constituer une approche thérapeutique permettant d’augmenter l’activité enzymatique résiduelle, afin d'améliorer, voire de lever, le déficit fonctionnel de ß-oxydation ou de chaîne respiratoire induit par le déficit enzymatique.

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Orientations de l’équipe, activités récentes

     Preuve de concept d’une correction pharmacologique d’un déficit de la ß-oxydation mitochondriale par le bézafibrate. A l’appui de notre hypothèse, nous avons d’abord établi la preuve de concept, sur fibroblastes de patients en culture primaire, d’une correction possible d’un déficit de la ß-oxydation (déficit en Carnitine Palmitoyl Tranférase 2 ou CPT2) après traitement par le bézafibrate. Le bézafibrate est médicament prescrit depuis plus de vingt-cinq ans pour le traitement de l’hyperlipidémie, qui agit en tant qu’agoniste des récepteurs nucléaires de type PPAR (Peroxisome Proliferator Activated Receptor). Ainsi, nous avons établi qu'une exposition au médicament pendant 48 à 72h entraine, via l’activation de PPAR, une élévation des ARNm et de la quantité de protéine CPT2 mutée (Figure 2). Cette synthèse accrue de la protéine mutée, induite par le bézafibrate, conduit à une augmentation significative de l'activité CPT2 dans les cellules déficitaires, qui permet la restauration des capacités normales d'oxydation des acides gras dans la voie de ß-oxydation, comme l'indiquent les mesures d'oxydation du palmitate tritié par les cellules de patient traitées.

Cette première étude a montré que la correction du déficit en CPT2 pouvait être obtenue dans plusieurs souches de fibroblastes de patients porteurs de mutations responsables de la forme myopathique du déficit, caractérisée par un déficit partiel en CPT2. Par contre, le bézafibrate n’a eu aucun effet dans les cellules présentant un déficit complet de l’activité CPT2, sans activité enzymatique résiduelle (forme sévère, beaucoup plus rare, du déficit) (Figure 3). A la suite de ces travaux, nous avons montré que le bézafibrate était également capable de corriger le déficit en CPT2 dans les cellules musculaires de patients, et que cet effet impliquait spécifiquement l'isoforme delta des récepteurs PPAR. Ces résultats constituaient la première preuve de principe d'une correction pharmacologique d'un déficit de ?-oxydation.

     Extension à un autre déficit de ß-oxydation. Ce concept a ensuite été étendu avec succès à un autre déficit de ?-oxydation, le déficit en VLCAD (Very-Long Chain-AcylCoA Dehydrogenase), qui touche la 1ère étape de l'hélice de Lynen. Le déficit en VLCAD présente au moins trois phénotypes distincts. La forme la plus sévère, qui se déclare chez le nouveau-né, entraîne souvent le décès du fait de troubles du rythmes cardiaques associés à une insuffisance hépatique aigue. Il existe également une forme infantile de cette maladie caractérisée par des épisodes de coma hépatique. Enfin, la forme myopathique du déficit en VLCAD, qui se déclare vers la puberté ou chez le jeune adulte, se caractérise par des myalgies et des crampes accompagnées d'un risque élevé de rhabdomyolyse (destruction de la masse musculaire) en réponse à l'exercice, au jeûne, ou à la fièvre, ainsi qu'à la plupart des situations entraînant une élévation du métabolisme basal. Cette diversité des manifestations de la maladie illustre bien l'hétérogénéité clinique souvent observée dans l'ensemble des déficits héréditaires du métabolisme oxydatif mitochondrial. Il n'existe actuellement aucun traitement efficace pour le déficit en VLCAD. L'étude des bases moléculaires de cette maladie a révélé l'existence d'un grand nombre de mutations différentes (>100), incluant une proportion élevée de mutations ponctuelles compatibles avec la production d'une protéine mutante (Figure 4). Il est cependant très difficile de prédire les effets de différentes mutations ponctuelles, réparties sur les vingt exons du gène, sur la structure et l'activité de l'enzyme, et on ne disposait que de peu de mesures des activités enzymatiques résiduelles dans les différents génotypes de la maladie.

Pour évaluer le potentiel du bézafibrate, nous avons donc étudié un large panel de cellules de patients, représentant une quarantaine de génotypes distincts correspondant aux trois principaux phénotypes de la maladie. L'étude de la réponse au bézafibrate dans ces cellules en culture a révélé un effet correcteur du médicament dans toutes les souches cellulaires issues de patients présentant la forme myopathique du déficit en VLCAD, et a permis d'identifier un ensemble de mutations ponctuelles compatibles avec cette réponse pharmacologique (pharmacogénétique) (Figure 5). Les mécanismes d'action du médicament sont proches de ceux mis en évidence dans le déficit en CPT2, à savoir une activation des récepteurs PPAR delta par le bézafibrate, conduisant à une élévation des ARNm, de la protéine, et de l'activité enzymatique VLCAD résiduelle. Les résultats soulignent également le potentiel très élevé d'induction de l'activité VLCAD par le bézafibrate dans les cellules de patient, en dépit de valeurs basales souvent fortement déficitaires, illustrant l'efficacité d'une stimulation pharmacologique des systèmes endogènes de régulation d'expression génique que sont les récepteurs PPAR (cible thérapeutique).

     Bézafibrate et correction des déficits de chaîne respiratoire. Les travaux ultérieurs de l'équipe ont été menés dans des cellules de patients atteints de déficits de la chaîne respiratoire mitochondriale (Figure 6). Ces maladies, caractérisées par un déficit complet ou partiel d'un des 5 complexes de la chaîne respiratoire mitochondriale, constituent le plus grand groupe de maladies génétiques du métabolisme chez l'homme, avec une incidence estimée à 1/8500 naissances. Ils sont associés à des mutations de gènes nucléaires, ou de gènes portés par l’ADN mitochondrial. Ces déficits se caractérisent par une extraordinaire variété de phénotypes, pouvant atteindre de nombreux organes, à tous les âges de la vie. A de rares exceptions près, ces pathologies sont actuellement incurables.

Nos travaux ont été menés dans un panel de fibroblastes de patients déficitaires en complexe I, II, III, ou IV de la chaîne respiratoire, porteurs de mutations de gènes nucléaires, et dans des cellules témoin. Nous avons montré que l'exposition au bézafibrate induit une élévation des quantités de protéine de plusieurs sous-unités des cinq complexes de la chaîne respiratoire dans les cellules témoins, et une production accrue de la protéine mutée dans plusieurs souches déficitaires (Figure 7). Cette induction entraine une augmentation de l'activité enzymatique déficitaire (mesurée par spectrophotométrie) qui conduit, dans certains cas, à restaurer des valeurs normales de consommation d'oxygène par les cellules malades (mesurées par polarographie).

Les mécanismes d'action du bézafibrate sur la chaîne respiratoire sont plus complexes que dans le cas de la ß-oxydation, et sont vraisemblablement indirects puisqu'on n'a pas mis en évidence d'éléments de réponse aux PPAR sur les promoteurs des gènes nucléaires codant pour les sous-unités de la chaîne respiratoire, ou pour les protéines auxiliaires associées à cette voie métabolique. L'hypothèse la plus probable est que l'effet du bézafibrate repose sur sa capacité à stimuler la transcription d'un co-activateur transcriptionnel, appelé PGC1-alpha, qui permet le recrutement et l'activation d'un ensemble de facteurs de transcription (dont les NRFs, pour Nuclear Respiratory Factors) connus pour contrôler l'expression de nombreux gènes intervenant dans la chaîne respiratoire. Ce co-activateur contrôlerait également les mécanismes de biogenèse des mitochondries, et constituerait ainsi un élément clé dans la régulation du métabolisme énergétique mitochondrial, et une cible thérapeutique majeure pour la correction de ces déficits (cf paragraphe suivant). Ces études fournissaient les premières données suggérant un effet potentiel du bézafibrate dans cette grande famille de maladies rares. Plusieurs autres équipes, travaillant notamment sur des modèles murins de déficits de complexes de la chaîne respiratoire, ont récemment établi un effet bénéfique du bézafibrate sur l'évolution de la maladie dans ces différents modèles in vivo.

     De la cellule au patient : essai clinique du bézafibrate dans la forme musculaire du déficit en CPT2. Les résultats obtenus in vitro sur cellules de patients nous ont conduit à organiser un essai clinique du bézafibrate dans la forme modérée du déficit en CPT2. Cette pathologie se traduit par une myopathie, caractérisée par des épisodes de raideurs musculaires accompagnées de myalgie et d’un risque élevé de rhabdomyolyse, en réponse à différentes situations (exercice physique, jeûne, fièvre etc…). Il n’existe aucun traitement satisfaisant pour cette myopathie. L’essai du bézafibrate a été réalisé à l’Hôpital Necker (Dr. J.P. Bonnefont, Service de Génétique et Dr J.L. Bresson, CIC de Necker), en collaboration avec l’hôpital de La Pitié Salpétrière (Dr P. Laforêt). Il s’agissait d’un effet ouvert mené sur six patients sur une période initiale de six mois, à la dose de bézafibrate normalement utilisée pour le traitement de l’hyperlipidémie (3x200 mg/jour). Les principaux critères d’efficacités étudiés étaient les capacités d’oxydation du palmitate dans le muscle des patients (biopsie musculaire), ainsi que l’expression des ARNm et de la protéine CPT2 dans le muscle, associés à un ensemble de critères cliniques (douleur et rhabdomyolyse) et à une analyse de qualité de vie grâce au questionnaire SF36.

En résumé, les résultats obtenus ont démontré une augmentation significative des capacités d’oxydation de la palmitoyl-L-carnitine, substrat spécifique de la CPT2, dans le muscle des patients, après six mois de traitement par le bézafibrate (Figure 8).

Au plan clinique, le traitement par le bézafibrate s’est traduit par une amélioration sensible des index de qualité de vie (SF36), en particulier par une diminution des douleurs musculaires et des épisodes de rhabdomyolyse, accompagnée d’une augmentation de l’activité physique spontanée. A la suite de cette première étude, le traitement par le bézafibrate a été prolongé pour une période de 3 ans, à la demande des patients. Le suivi à long terme des patients traités a permis de confirmer le recul des épisodes de douleurs musculaires et de rhabdomyolyse en réponse au médicament. Parallèlement, l’amélioration des indices de qualité de vie (SF36), relevée après six mois de traitement, a été confirmée par cette étude à long terme, et le traitement n’a entraîné aucun effet indésirable. En dépit des limites inhérentes à cet essai pilote (faible effectif, essai en ouvert), les données ainsi recueillies suggèrent clairement un effet thérapeutique du bézafibrate dans la forme myopathique du déficit en CPT2. Nous poursuivons, avec l’Association Française contre les Myopathies (AFM), qui a soutenu ce travail, le projet d’un essai à plus large échelle, en double aveugle contre placebo, du bézafibrate dans les déficits en CPT2 ou en VLCAD.

Projets en cours

Thérapie pharmacologique des déficits mitochondriaux et signalisation métabolique.

Nos travaux récents ont permis de valider une approche pharmacologique basée à la fois sur les mécanismes d’action du médicament (nature de la cible thérapeutique et fonctionnement des voies de signalisation associées), et sur les caractéristiques biochimiques et moléculaires des déficits de ß-oxydation ou de chaîne respiratoire (nature du gène muté, nature des mutations, conséquences structurales et fonctionnelles des mutations). Notre hypothèse initiale d’un effet thérapeutique du bézafibrate, via PPAR, a pu être testée dans plusieurs types de déficits mitochondriaux, en s’appuyant sur une banque de cellules de patients constituée dans l’équipe en collaboration avec les centres de référence de ces maladies rares. En parallèle, nos recherches s’appuient sur un ensemble de méthodes d’études mises en place dans notre équipe, allant de l’expression des différentes protéines enzymatiques aux fonctions métaboliques mitochondriales dans la cellule intacte. Enfin, les résultats de l’essai clinique du bézafibrate (cf plus haut) suggèrent que cette stratégie peut, au moins dans certains cas, ouvrir sur des applications cliniques (recherche translationnelle) chez les patients porteurs de déficits du métabolisme oxydatif.

Notre objectif est d’étendre l’étude des approches pharmacologiques de ces déficits, pour lesquels, comme nous l’avons vu, il n’existe encore que très peu de traitements.  Sur cette base, les projets actuels de l’équipe sont centrés sur le co-activateur de transcription PGC1-alpha (Peroxisome etc…), qui est actuellement considéré comme un acteur majeur de la régulation du métabolisme oxydatif mitochondrial, et de la biogenèse de ces organites. PGC1-alpha, initialement identifié dans le tissu adipeux brun en tant que régulateur de la thermogenèse, est fortement exprimé dans de nombreux tissus à demande énergétique élevée (cœur, cerveau, rein, etc…). PGC1-alpha agirait en tant que plateforme capable de recruter un grand nombre des facteurs de transcription (PPAR, NRF, FOXO, etc…) connus pour réguler les voies de ß-oxydation et de chaîne respiratoire. Ainsi, l’activité de PGC1-alpha contrôle l’expression de nombreux gènes dans ces voies métaboliques, et PGC1-alpha constitue donc une cible thérapeutique d’un intérêt majeur pour la correction de déficits du métabolisme oxydatif.

Plusieurs mécanismes, impliquant des modifications post-traductionnelles de la protéine, interviennent dans le contrôle de l’activité de PGC1-alpha. Ce co-activateur est en particulier activé par dé-acétylation, une réaction catalysée par une enzyme de la famille des sirtuines,  SIRT1, qui appartient au groupe des déacétylases d’histones dépendantes du NAD. phosphorylation de PGC1-alpha, pourraient également jouer un rôle majeur dans le contrôle de ce co-activateur.

Les principaux objectifs de notre travail actuel sont d’évaluer le potentiel de différentes classes de molécules potentiellement capables de cibler PGC1-alpha, qui seront testées dans notre panel de cellules déficitaires en ß-oxydation (déficit en CPT2 ou en VLCAD) ou en chaîne respiratoire (déficits en complexe I ou IV). Un autre objectif majeur est d’évaluer les contributions des différentes voies de signalisation impliquant PGC1-alpha dans les effets observés. On sait en effet que PGC1-alpha constitue un élément central au cœur d’un réseau de voies de signalisation capables de moduler les fonctions mitochondriales de production d’ATP. Les modèles cellulaires étudiés dans l’équipe fournissent un outil précieux pour évaluer l’importance relative de ces différentes voies de signalisation dans le contrôle des protéines du métabolisme oxydatif, et de l’activité des voies métaboliques correspondantes.

Cet axe de recherches s’inscrit dans le champ plus général de la régulation du métabolisme énergétique par des mécanismes transcriptionnels ou post-transcriptionnels, qui constitue un enjeu très important dans le traitement des maladies métaboliques communes (diabète de type 2, obésité, etc…). La régulation des fonctions mitochondriales, et la signalisation associée, constituent également un domaine d’investigation important dans un ensemble de maladies neurodégénératives. Ainsi, à partir d’une thématique centrée sur des maladies génétiques représentant des exemples extrêmes et multiples de déficits du métabolisme énergétique mitochondrial, les recherches de l’équipe offrent des interfaces possibles avec un ensemble d’autres pathologies dont l’étiologie pourrait faire intervenir des altérations des fonctions mitochondriales de production d’énergie.